본 발명은 신규한 구제역 백신 항원 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 불활화된 구제역 바이러스에 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시하여 비구조 단백질(NSP; Non Structural Protein)을 제거하고 구제역 바이러스 백신 항원을 획득하는 단계를 포함하는 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 백신 항원 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법을 통해 비결합 용출(Flow-through) 방식으로 비구조단백질을 제거하고 용이하게 구제역 백신 항원을 제조하는 경우, 종래 방식에서 발생하는 경제성과 백신항원 회수율 저하와 같은 한계점이 극복되었다. 또한, 본 발명의 방법에 따른 백신 항원을 접종 시 비구조단백질 항체 유도의 우려가 없으므로 안전하며 효과적인 국내 구제역 백신항원 제조 기술로 활용 가능하다.