본 발명은 호박분말, 자당 및 탈지유를 포함하는 유산균 동결 보존용 조성물, 유산균 동결 보존제 및 상기 유산균 동결 보존용 조성물을 유산균에 처리하여 이를 동결 보존 및 손상을 방지하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 동결보존제로 사용하는 호박분말, 자당 및 탈지유를 포함하는 동결 보존용 조성물은 다양한 유산균을 프로바이오틱스로 제조함에 있어서 그 유산균의 장기 보존을 위한 동결 건조 과정에서의 유산균의 동결보존 효과가 종래의 동결보존제에 비해 매우 뛰어나 동결 건조 후 유산균의 생존율이 높을 뿐 아니라, 식품등급의 재료로서 안정성을 제공한다. 따라서, 본 발명의 호박분말, 자당 및 탈지유를 포함하는 동결 보존용 조성물을 이용하면 유산균의 동결건조 후 생존율을 극대화시켜 고품질 프로바이오틱스의 생산을 가능하게 하며, 프로바이오틱스 품질 균일화 및 품질 유지를 위한 종균으로서의 유산균을 낮은 단가로 공급할 수 있다.